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IBV: Muestreo, significado e interpretación de las pruebas de laboratorio

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La Bronquitis Infecciosa Aviar (BI) puede causar enfermedades respiratorias, nefritis y nefrosis, con descenso de la puesta y la mala calidad de los huevos.

Estos síntomas, sin embargo, no son patognomónicos de la enfermedad:

Para llegar a un diagnóstico definitivo se puede hacer un análisis de laboratorio, con el objetivo de la identificación específica la infección del virus IB (IBV).

El aislamiento del virus y su tipificación es decisivo, pero largo y costoso; para identificar rápidamente la presencia de IBV se utilizan principalmente la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la inmunofluorescencia (IFA).

La presencia de anticuerpos se detecta mediante pruebas serológicas como la inhibición de la hema- glutinación (HI), precipitación en gel de agar (AGP) y el análisis de inmunoabsorción enzimática (ELISA).

 
Cómo hacer el muestreo
 
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Por ejemplo, en la fase aguda, con síntomas comunes y obvios sólo unas pocas muestras son necesarias, debido a que el IB es una enfermedad altamente infecciosa con una alta morbilidad (índice de infectividad R0 = 20) y por lo tanto la prevalencia es alta.
 
¿Pero qué programa diagnóstico debe realizarse en en el campo? ¿Se necesitan tales pruebas?

Depende en gran medida de las situaciones sobre el terreno, de las condiciones epidemiológicas, el tipo de animales y muchas otras variables. En la práctica veterinaria diaria, se continúa trabajando.

En el caso de las muestras de sangre para serología. El suero se obtiene de la sangre entera (no tratado con anticoagulantes) dejando enfriar a temperatura ambiente para evitar que coagule demasiado rápido y luego se centrifuga. Posteriormente, la fase líquida se separa de las células: es conveniente actuar rápidamente para evitar la hemólisis, que convierte la muestra en inservible. El tubo con el suero debe estar debidamente etiquetado, almacenado en el refrigerador, y se entrega al laboratorio tan pronto como sea posible, de lo contrario, se congela.

 
tabla prevalencia IBV
 

EXTRACCIONES PARA DETECTAR LA PRESENCIA DEL ANTÍGENO IBV POR TINCIÓN (IFA Y IPA).

Con estas pruebas no se aísla el virus IB, pero ponen de manifiesto si está presente en los tejidos analizados. Las muestras de órganos deben ser fijadas en formalina y se envían al laboratorio de referencia.

EXTRACCIONES PARA PRUEBAS GENÓMICAS (PCR Y RT-PCR)

Estas pruebas detectan la totalidad o parte del genoma del virus de bronquitis infecciosa pero no es necesario que el virus esté vivo, es sólo una cuestión de estabilidad química. La muestra, por tanto, no es particularmente sensible a los cambios de temperatura ni tampoco en el secado.

Se pueden utilizar los órganos aislados y refrigerados, pero es mucho más práctico utilizar hisopos (in vivo, como la tráquea y / o la fosa palatina) o tarjetas FTA después de la necropsia.

Estos son fáciles de usar y muy adecuados a la actividad en el sector veterinario. El material a analizar se mantiene estable durante largos períodos y es práctico para enviar por correo las tarjetas de análisis de laboratorio, en un sobre simple como una carta.

ÓRGANOS PARA EL AISLAMIENTO VIRAL

El virus de BI es muy frágil y es difícil mantenerlo vivo en el material recogido. Por lo tanto, la muestra debe ser refrigerada inmediatamente después de su recogida y entregada al laboratorio en un tiempo muy breve, manteniendo la cadena de frío.

 
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PRUEBAS DE LABORATORIO

AISLAMIENTO

Todo IBV se puede aislar a partir del tracto respiratorio superior, la puerta de entrada de la enfermedad y el sitio principal de la replicación viral.

La concentración viral es máxima en la tráquea durante la fase aguda de la infección es decir, entre 3 y 5 días después de la infección. Basándose en el tropismo de la cepa implicada, el virus viaja a través del cuerpo y comienza a multiplicarse en los otros órganos diana: riñones, oviductos, tracto gastrointestinal. A partir de la segunda semana de infección la concentración desciende y en la fase crónica, el virus se puede encontrar, sobretodo en la cloaca, variando en función de la cepa y su tropismo específico.

 

El aislamiento del virus se realiza en huevos SPF embrionados o en TOC (cultivos de órganos traqueales). Durante la fase aguda de la infección por el IBV, si los pollos no están protegidos, serán muchos individuos con elevada concentración de IBV en la tráquea y por lo tanto será suficiente con el sacrificio de algunos animales. Por el contrario en caso de infección de los pollos vacunados bien-o infección crónica (como ponedoras o reproductoras) la prevalencia de la infección es baja: apareciendo pocos virus de BI en algunos sujetos.

En este caso, es conveniente tomar muestras de un mayor número de sujetos, del tracto respiratorio, los riñones, las tonsilas cecales y la cloaca. Para preservar IBV lo mejor posible, la toma de muestras para el aislamiento del virus deben ser llevados a una temperatura de 4°C en el menor tiempo posible y el aislamiento debe comenzar dentro de las 24 horas de la recogida.

En caso de períodos más largos, las muestras deben congelarse a -20°C En estas condiciones, el virus sigue siendo viable durante varios días. Sin embargo el aislamiento viral es laborioso, lento y costoso.

Para acelerar el proceso se suele comenzar con el procedimiento de aislamiento acompañado por una segunda técnica tal como la IFA o mejor aún una PCR para identificar el virus. Esto acelerará el proceso de identificación, sin perder sensibilidad.

 

IDENTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO IBV

La prueba de identificación del antígeno IBV utilizando anticuerpos específicos, ya sea con antisueros o con anticuerpos monoclonales (Mab). Los antisueros se obtienen de pollos hiperinmuni- zados previamente al antígeno IBV, por lo tanto un antisuero contiene anticuerpos frente a diferentes partes del virus. La evaluación estandarizada y su éxito puede verse obstaculizado por los cambios biológicos debido tanto a las características del virus salvaje como por las respuestas de los sujetos hiperinmunizados.

Un Mab responde a un único epítopo (o un pequeño número de ellos) de un antígeno IBV y por lo tanto proporciona un buen resultado, reproducible y muy específico.

La desventaja en el uso de la Mab es que la mutación de un solo nucleótido puede dar lugar a un aminoácido diferente de aquel frente al que reacciona un Mab, impidiendo la respuesta. En función del Mab usado, la respuesta podría ser que el virus no sea el serotipo probado, o que incluso no sea IBV. La solución se puede encontrar utilizando más Mab (en un panel de anticuerpos monoclonales) o un Mab dirigido a áreas esenciales del virus (y por tanto no mutantes).

El riesgo de un falso diagnóstico se reduce mucho cuando se utilizan sueros policlonales frente a más epítopos.

 
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Frente a los primeros síntomas respiratorios, es vital que el diagnóstico sea lo más rápido posible.
 
INMUNOFLUORESCENCIA (IFA)

Prueba rápida y barata, pero no muy sensible, que requiere una alta concentración de IBV en el órgano afectado. Por esta razón, se utiliza principalmente en la fase aguda de la enfermedad y en individuos jóvenes.

Cuando se utiliza el antisuero policlonal-IFA es una prueba específica de grupo y a veces la interpretación puede ser complicada por las reacciones inespecíficas, pero si se utiliza Mab-IFA se convierte en una prueba específica de tipo, más fiable.

INMUNOPEROXIDASA (IPA)
La sensibilidad de la prueba es similar a la anterior pero pueden ser fijados en formalina. La prueba permite evaluar tanto los “portadores” de las células del virus como la morfología del tejido. Un microscopio común es suficiente para la evaluación de los resultados y las preparaciones se pueden almacenar normalmente, debido a que los tejidos están fijados.

DESVENTAJAS:

  • Técnica más laboriosa y más larga, a menudo apareciendo reacciones inespecíficas.

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    CLASIFICACIÓN DEL VIRUS

    La correcta y rápida identificación del virus no sólo le permite adoptar medidas de control más específicas, sino que proporciona una importante información epidemiológica. Los estudios moleculares han demostrado que siempre surgen nuevos serotipos y genotipos de IBV (por mutación sencilla de unos pocos aminoácidos del peplómero), mientras que el resto del genoma permanece sin cambios.

    Además se ha demostrado que el virus puede recombinarse durante las infecciones mixtas generando cepas nuevas que pueden llegar a ocasionar como ha sucedido en Hungría donde una cepa nefropatógena aislada de un broiler era una combinación entre IBVM41, una parte fe 793/B y otra parte de B1648.

    Los sistemas de clasificación se pueden dividir en dos grupos principales:

  • Pruebas funcionales: que se refieren a la actividad biológica del virus (protectotipo, serotipos o tipos antigénicos)
  • Pruebas no funcionales: que se centran en el genoma del virus de bronquitis infecciosa (genotipos).
  • La elección depende de las posibilidades técnicas, los costes y los objetivos de la investigación (programas de vacunación, epidemiología), científicos o prácticos.

     
     

    PRUEBAS FUNCIONALES

    PROTECTOTIPO

    Frente a un problema de la Bronquitis Infecciosa el serotipo de IBV implicado no es relevante (aunque es fundamental para las investigaciones epidemiológicas), pero ¿qué tipo de vacuna que se usa para proteger a los animales?.

    La pregunta es, mi pollo está vacunado, ¿pero también se protege de esta infección? El sistema es muy práctico a nivel de campo, pero supone un gran número de pruebas caras y complicadas en el laboratorio, para ver las reacciones de infección y protección cruzada.

     
     
    TIPOS ANTIGÉNICOS

    SEROTIPIFICACIÓN

    Basado en la reacción entre una cepa IBV y anticuerpos específicos de pollo. La especificidad es alta pero la prueba no tiene estándar reconocido, por lo que los resultados difieren entre laboratorios y no siempre son comparables. Ahora está en desuso, excepto para los pruebas específicas.

    TIPIFICACIÓN DE LOS EPÍTOPOS

    Basada en principios similares de serotipificación, utilizando anticuerpos monoclonales (Mab). El uso de Mab permite comprobar si un epítopo particular (o un grupo de epítopos) está presente en una cepa del IBV. Con Mab conocido (o prevalente en la región) se prepara un panel frente a lo que Mab reacciona.

    Este método puede conducir a errores debido a que algunos IBV tienen reacciones cruzadas con IBV clásica, como fue el caso de la cepa QX-like, positivo para Mab IB genérico y luego M41, inicialmente clasificada como una cepa M41 nefropatogénica. En la práctica, se dice que la mutación en un epítopo particular significa que la cepa ha mutado hacia un serotipo diferente, y viceversa. Por esta razón, cuando un IBV no reacciona en un panel de Mab, se prueba con una técnica diferente para determinar lsi la cepa es en realidad un mutante o no. El método está cayendo rápidamente en desuso.


    PRUEBAS NO FUNCIONALES

    GENOTIPIFICACIÓN

    La caracterización genética de una parte del genoma del IBV ha conducido a la clasificación de las familias de las cepas, o grupos, que están genéticamente relacionados entre si.

    El resultado de la prueba es objetivo y proporciona información esencial para las investigaciones epidemiológicas. Su uso en el campo está limitado, debido a que no siempre (o nunca) se puede asociar la información del genoma de IBV a sus funciones biológicas o antigénicas.

    IBV pertenecientes al mismo serotipo o protectotipo pueden diferir drásticamente desde el punto de vista genético, mientras que protectotipos o diferentes serotipos pueden tener un genómico similar al de otro IBV, sin dar información sobre la naturaleza antigénica, siendo realizar una serotipificación o incluso con estudios in vivo.

    SECUENCIACIÓN

    Es una técnica fundamental para estudios epidemiológicos, permite construir un árbol filogenético, pudiendo revelar las relaciones genómicas entre las diferentes cepas.

    Los datos de secuenciación proporcionan información sobre la estructura primaria de las proteínas (secuencias de aminoácidos) que normalmente no se pueden traducir directamente en la función biológica o antigenicidad. La situación se complica cuando nos encontramos frente a IBV recombinantes.

     
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    POLIMORFISMOS EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP)

    Debido a las características de esta prueba es capaz de proporcionar un diagnóstico rápido, incluyendo la tipificación del virus. Pero puede haber problemas en la traducción de los datos a las funciones biológicas o antigénicas; Aunque la correlación entre el patrón de RFLP y serotipo es elevada, puede que los diferentes fragmentos, introducidas por RFLP sean del mismo genotipo, siendo de hecho, de serotipo o protectotipo tan diferentes.

    Incluso en este caso, si se tiene la sospecha de un diagnóstico impreciso desde el punto de vista de las características biológicas, sería necesario realizar pruebas convencionales o los estudios in vivo.

    REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).

    Es la prueba más utilizada por razones prácticas, la sensibilidad, especificidad y fiabilidad.

    La elección de cebadores para uso es un aspecto esencial para el éxito de la PCR, ya que debe ser capaz de hibridarse específicamente y de manera eficiente a la secuencia de interés, dejando de lado las inespecíficas. El tipo de cebador utilizado varía dependiendo del propósito de la PCR, pero debido a la gran variabilidad de IBV no es fácil tener todos los cebadores capaces de identificar todas las cepas conocidas y de importancia epidemiológica y patogénica.

    Hay dos pruebas principales. Un tipo de PCR se dirige hacia la proteína S1 hipervariable del peplómero. La prueba ayuda a analizar las cepas conocidas y a descubrir nuevas cepas variadas. Pero si en un sujeto que tenía sobreinfecciones con diferentes cepas del IBV, la prueba mostraría sólo las secuencias “mixto” sin poder distinguir los diferentes serotipos.El segundo tipo de PCR es genotipo específico, que es incapaz de identificar las cepas ya conocidas y frecuentes. No es adecuado para identificar la presencia de nuevas variantes del IBV.

    REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA INVERSA (RT-PCR).

    Partiendo del ARN viral, con una enzima específico, es posible iniciar la síntesis de una cadena de ADNc (ADN complementario) correspondiente. Es una técnica cada vez más utilizada, aunque la sensibilidad depende de los órganos de partida, baja y, por tanto, requeriría una multiplicación previa de ‘IBV en huevos embrionados o TOCs. También hay que realizar los controles adecuados para controlar la prueba y la posible contaminación cruzada.

    La combinación de las dos pruebas de PCR y la comparación entre los resultados podrían tener buenas respuestas de diagnóstico.


     
     
    PRUEBAS SEROLÓGICAS

    Cuando se procede a la toma de muestras y a la posterior interpretación de los resultados serológicos, debemos tener en cuenta que la respuesta inmune es inducida por la infección del patógeno y no contra los signos clínicos de la enfermedad. Así que cuando la enfermedad se manifiesta, a los pocos días después de la infección, la respuesta inmune podría estar aun comenzando o incluso haber finalizado. No hay pruebas inmunológicas, con una sensibilidad y especificidad del 100%, debido a que estas dos características son inversamente proporcionales: cuanto mayor sea la sensibilidad, la especificidad disminuye.

    Una infección IBV puede diagnosticarse mediante la demostración de la aparición o aumento de los títulos de anticuerpos específicos: IgM e Ig total. Para demostrar la seroconversión inducida, existe una estrecha relación entre la infección y el inicio del muestreo llevado a cabo. Con la aparición de los primeros síntomas sospechosos se debe recoger sangre y suero, identificar y congelarlos. Si más adelante en el tiempo (mínimo dos semanas) son requeridos para la confirmación de la infección, se debe realizar una segunda extracción. Las dos muestras se analizan a la vez (para evitar errores relacionados con las variaciones diarias). La comparación entre la primera toma de muestras y la segunda tiene un buen nivel de fiabilidad diagnóstica.

    La interpretación de los resultados serológicos se complica debido a la seroconversión de la vacuna, a las infecciones pasadas, a las reacciones cruzadas entre distintos serotipos y por la aparición de nuevas cepas de IBV: la tarea del veterinario es determinar si se trata de un anticuerpo pasada la infección de campo o se trata de una respuesta normal a la vacunación.

    ANÁLISIS ESPECÍFICOS DE GRUPO

    Estas pruebas (Elisa, SGPT) no distinguen entre anticuerpos inducidos por diferentes cepas: aunque el antígeno utilizado pertenezca a un serotipo específico (por ejemplo, Massachusetts) también detecta anticuerpos contra otros serotipos.

  • Precipitación en gel de agar:
  • La prueba no requiere equipo especial. El uso de un suero control en una cabina adyacente al que contiene el suero de ensayo permite identificar la precipitación de bandas específicas de no específico. (Woernie, 1966). Esta capacidad explica la gran especificidad de la prueba. La prueba es simple, pero no estandarizada. La precipitación se observa con sólo una semana después de la vacunación o infección, pero tiende a disminuir después de unas pocas semanas. Por esta razón, un positivo indica contacto reciente con IBV. La sensibilidad puede variar de 0 a 100% en relación a la cepa IBV utilizada, la vía de administración, la edad, la presencia de MDA o inmunidad previa, etc.

    Si la prueba no se valida, los resultados no serán fiables. El uso estas pruebas con fines de diagnósticos es difiícil, ya que no da respuestas claras, pero sí datos para interpretar. Los anticuerpos pueden ser identificados dentro de una semana después de la vacunación o infección, sino para demostrar un movimiento para demostrar cambios en los niveles de anticuerpo debe hacerse una primera prueba con la aparición de los primeros síntomas (que aparecen 18-36 horas después de la infección) y un segundo al menos dos semanas después. El procesamiento de las dos muestras al mismo tiempo, se puede demostrar aumento de anticuerpos y la seroconversión. Pero si la primera muestra se tomó en el momento equivocado, podría ser imposible ver la seroconversión y luego pensar que se ha producido.

     

    IgM ELISA

    La IgM específica está presente durante un corto período de tiempo. Su identificación es evidencia de una infección reciente (o vacunas). Los resultados, sin embargo, no siempre son coherentes, fiables y, a menudo hay un conflicto con la realidad. La técnica todavía se estudia en profundidad antes de ser validado en el terreno.

     
     
    PRUEBAS ESPECÍCAS DE SEROTIPO

    Le permiten reconocer e identificar los anticuerpos inducidos por diferentes cepas de IBV y / o diferentes serotipos. La neutralización del virus (VN) es de las pruebas preferidas para la identificación de los serotipos de IBV, con anticuerpos específicos. La especificidad es muy alta, incluso después de un único “contacto” con el IBV. Sólo después de repetidos contactos con diferentes IBV pueden producirse reacciones cruzadas.

    Inhibición de la Hemaglutinación (HI)

    Los anticuerpos IH son detectables a partir de 1-2 semanas después de la infección (o de vacunación). La prueba, al igual que la VN, es específica de serotipo aunque su especificidad es menor que la de la VN y es incluso más baja si las infecciones IBV son múltiples con diferentes serotipos. De hecho, la sucesión de diferentes infecciones IBV puede inducir anticuerpos que reaccionen en la prueba de IH con los serotipos a los que los pollos no fueron expuestos.

    ELISA específica de serotipo

    Esta prueba, ideada en 1993 parecía ser muy prometedora, pero en la práctica aparecían muchas reacciones cruzadas heterólogos en reinfecciones con IBV homólogos. Se han hecho muchos estudios comparativos sobre la sensibilidad de las distintas pruebas serológicas: los resultados son muy diferentes y no definitivos. En la práctica, podemos decir que temporalmente los primeros anticuerpos pueden ser detectados por ELISA, después con precipitación en gel de agarosa y HI y finalmente con VN.

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