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Diagnóstico de la Bronquitis Infecciosa

Los diferentes tipos de vacunas contra la enfermedad de Gumboro
29 septiembre, 2021
 

Introducción

El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) es un patógeno muy contagioso y extendido, responsable de graves pérdidas económicas para el sector avícola. Su control, que se consigue principalmente mediante la combinación de medidas de bioseguridad adecuadas y la vacunación, se ve frustrado por su elevada variabilidad genética, que provoca la aparición continua de nuevas variantes patógenas.

Dado que diferentes variantes genéticas del IBV podrían causar diversos síntomas y podrían requerir diferentes vacunas, es crucial un seguimiento epidemiológico continuo y atento para saber qué variantes están circulando dentro del área de interés.

 

Por lo tanto, los medios de diagnóstico para identificar una infección por IBV deben ser rápidos, robustos y posiblemente baratos

 

El profesor Mattia Cecchinato (DVM, PhD, EBVS® European Specialistin Poultry Veterinary Science) se licenció en Medicina Veterinaria por la Universidad de Padua (Italia) en 2001 y realizó su doctorado y su beca postdoctoral en la Universidad de Bolonia.

Es profesor asociado del Departamento de Medicina, Producción y Salud Animal de la Universidad de Padua, Italia.

Sus principales intereses de investigación son los patógenos respiratorios en las aves de corral y, en particular, la epidemiología y el control de las infecciones virales debidas a los virus pertenecientes a Pneumoviridae y Coronaviridae.

 

Cómo elegir la prueba más adecuada para una correcta interpretación de los resultados del laboratorio

Dado que los signos clínicos inducidos por el IBV no son patognomónicos, se requieren pruebas de laboratorio para confirmar una infección por el mismo. Existen varios métodos de diagnóstico, como el aislamiento viral, la serología y los ensayos biomoleculares. Para elegir adecuadamente qué método utilizar, debe tenerse en cuenta el objetivo del diagnóstico.


1. Aislamiento vírico

El aislamiento vírico se lleva a cabo mediante la inoculación de una suspensión de una muestra de campo en huevos embrionados de gallina SPF; los huevos se incuban y, después de varias pasadas, si el virus está presente, es posible observar lesiones causadas por el IBV en los embriones. El IBV también puede cultivarse con éxito en tejido traqueal de gallinas.

Se pueden tomar muestras de diferentes órganos, dependiendo de los síntomas predominantes, y las muestras deben almacenarse cuidadosamente a 0-4°C y llevarse rápidamente al laboratorio para preservar la viabilidad del virus. A día de hoy no se utiliza como medio rutinario de diagnóstico, por ser un proceso lento, laborioso y con estrictos requerimientos.


2. Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas, como el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y la inhibición de la hemaglutinación (IH), permiten detectar y analizar los anticuerpos específicos contra el IBV, lo que proporciona información sobre las infecciones o sobre la respuesta a la vacunación: prácticamente, los títulos medios de anticuerpos se interpretan como una respuesta normal a la vacunación, mientras que los niveles de conversión más bajos sugieren que la vacunación no se ha realizado correctamente y los títulos elevados están relacionados con la exposición al virus de campo.

 
 

Figura 1. Resultados de las pruebas ELISA comerciales realizadas en manadas vacunadas en la incubadora con una combinación de vacunas Cevac Mass L® y Cevac IBird® (imagen cortesía de Paulet P.).


Los ensayos ELISA no permiten diferenciar las respuestas de los anticuerpos a diferentes serotipos, mientras que sí es posible hacerlo con el IH. Sin embargo, la fiabilidad del serotipado del IH puede verse afectada por la posible presencia de múltiples cepas de campo y vacunales, lo que podría dar lugar a respuestas de anticuerpos de reacción cruzada. Además, la posible presencia de anticuerpos maternales (MDA) en polluelos jóvenes complica aún más la evaluación de la toma de la vacuna.

 

3. Técnicas biomoleculares

Las técnicas biomoleculares (principalmente basada en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)), que permiten la detección del IBV evidenciando la presencia del ARN viral, son las pruebas más utilizadas en la actualidad, ya sea para confirmar una infección por el IBV o para evaluar la administración de vacunas e indirectamente su eficacia. Una de las principales características de la PCR es la posibilidad de determinar a qué genotipo pertenece una determinada cepa, una información crucial para planificar un protocolo de vacunación eficaz. Por otra parte, la positividad de la PCR no significa necesariamente que el virus sea viable y que se esté produciendo una infección en el momento de la toma de muestras, por lo que la interpretación de los resultados debe hacerse con cuidado.

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Ensayos de PCR: medios muy eficaces para el diagnóstico del IBV, siempre que se elijan bien los métodos de procesamiento de las muestras

 

Varios enfoques posibles a considerar para una correcta interpretación de los resultados

Las pruebas pueden ser genéricas, dirigidas a una región genómica común a todos los genotipos del IBV, o pueden ser específicas para un determinado genotipo.

Desde que las vacunas vivas atenuadas se utilizan ampliamente en el campo y pueden ser detectadas por PCR durante un largo período después de la administración, la gran mayoría de muestras suele resultar positiva a los ensayos genéricos, cuya utilidad (incluso para fines de cribado) es por lo tanto limitada. El uso de un panel de ensayos específicos proporciona información más útil sobre los genotipos que se buscan, pero por otro lado significa que las cepas no buscadas no serán detectadas.

Otra distinción es que algunas pruebas se basan en la RT-PCR clásica, mientras que otras se basan en la RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). La RT-PCR clásica puede ir seguida de secuenciación, lo que permite obtener información más precisa sobre el genoma de las cepas detectadas, mientras que los métodos en tiempo real proporcionan datos sobre la cantidad de ARN viral que está presente en la muestra, pero no permiten la secuenciación. Una RT-PCR genérica seguida de secuenciación permite la detección y la caracterización de prácticamente cualquier cepa de IBV.

En general, cuando hay múltiples cepas y se solicitan diferentes pruebas a distintos laboratorios los resultados pueden ser diferentes. En estas ocasiones, que no son inusuales, la elección del ensayo debe ser considerada para interpretar adecuadamente los resultados.

Los ensayos de PCR permiten distinguir entre cepas de campo y cepas de la vacuna basándose en las diferencias genéticas: aparte de las pruebas indirectas (es decir, la detección de una cepa perteneciente a un determinado genotipo en una población que no ha sido vacunada con una vacuna homóloga), la diferenciación se basa en análisis filogenéticos o detección de marcadores genéticos que se encuentran en las cepas vacuna en comparación con sus progenitores.


Estudios longitudinales para evaluar con precisión la cinética de la vacuna

Otra posibilidad que ofrece la PCR es realizar estudios longitudinales para evaluar con precisión la cinética de las vacunas a lo largo del ciclo de producción: saber a qué edad los títulos víricos de las vacunas alcanzan su punto máximo (normalmente a los 7-10 días después de la vacunación) y cuándo empiezan a disminuir podría resultar realmente útil para evaluar los procedimientos de aplicación de las vacunas. Por ejemplo, un trabajo recientemente publicado por Tucciarone et al. informó de la cinética de las vacunas Cevac IBird® y Cevac Mass L® cuando se aplican juntas a 1 día de vida (Figura 2). Dado que una réplica de la vacuna aplicada en diferentes combinaciones podría mostrar diferentes cinéticas, es importante evaluar todas las curvas para todos los diferentes protocolos.

 
 

Figura 2. Títulos de la vacuna Cevac Mass L® y Cevac IBird® en relación con la edad de los animales. Las dos vacunas se administraron juntas a 1 día de edad. Los puntos y triángulos representan los resultados de muestras individuales, mientras que las líneas continuas representan las tendencias generales (Tucciarone et al., 2018, ligeramente modificado).


Un enfoque de estudio longitudinal, que requiere un muestreo denso, también puede permitir determinar el momento en que los virus de campo aparecen en el lote, ayudando a identificar posibles debilidades en la bioseguridad.

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Ensayos PCR: el valor de los resultados está estrechamente ligado a la calidad y la elección de las muestras

 

Las muestras adecuadas para las pruebas PCR pueden recogerse a nivel orofaríngeo, traqueal, renal o cloacal. Las muestras orofaríngeas y traqueales se recomiendan para detectar cepas de campo cuando se sospecha una infección y para evaluar la vacuna de 5 a 7 días después de la vacunación. Se prefieren las muestras cloacales para detectar algunas cepas vacunales, que parecen replicarse y persistir durante mucho tiempo en las tonsilas cecales; sin embargo, la diseminación a este nivel puede ser intermitente. Las muestras de riñón son útiles para detectar la presencia de cepas nefrotrópicas, pero deben recogerse sólo cuando se observen lesiones renales. Las cepas detectadas en diferentes órganos muestreados al mismo tiempo pueden ser diferentes, ya que cada genotipo tiene características distintas en cuanto a su tropismo. Por lo tanto, el muestreo y el análisis de diferentes órganos no es redundante, de hecho, debe hacerse para reunir la mayor cantidad de información posible.

Las muestras se recogen generalmente por medio de hisopos, ya que el procedimiento es bastante fácil y los hisopos secos para el diagnóstico molecular pueden almacenarse durante varias semanas sin necesidad de refrigeración. Las tarjetas FTA también son muy prácticas: pueden almacenarse durante varios meses a temperatura ambiente y enviarse por correo ordinario; sin embargo, su uso puede conllevar una pérdida moderada de sensibilidad. Otra opción es recoger órganos de aves muertas, pero la conservación y el envío son obviamente más problemáticos.

Las muestras pueden procesarse individualmente o pueden agruparse: las muestras individuales están indicadas para estudiar la cobertura de la vacuna dentro de un grupo de animales, mientras que las muestras agrupadas son una forma más barata y utilizada para sacar conclusiones sobre todo el lote, generalmente para evaluar la presencia de virus de campo o la toma de vacunas. Diez hisopos se consideran comúnmente considerados suficientemente representativos de la situación del lote. Pueden tomarse muestras tanto de animales sanos como sintomáticos.

Para una mejor interpretación de los resultados, lo ideal es compartir con el laboratorio todos los datos posibles de los animales muestreados (por ejemplo, edad en el momento del muestreo, presencia de síntomas, protocolo de vacunación, localización de la granja).


En resumen

Cuando se recurre a métodos biomoleculares, el enfoque de diagnóstico (qué y cuántas muestras tomar, qué ensayos utilizar) debe decidirse teniendo en cuenta la edad de los animales, la posible presencia (actual o pasada) de síntomas clínicos, las vacunas que se administran y los genotipos que circulan en la región de interés. Tanto la RT-PCR como la RT-PCR en tiempo real(RT-qPCR), test genéricos y específicos deben combinarse para ser lo más inclusivos posible, recordando que la aplicación de diferentes ensayos podría conducir a resultados aparentemente contrastados.


Bibliografía

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  • De Wit J.J. (2000) Detection of infectious bronchitis virus. Avian Pathology, 29:2, 71-93.
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  • Tucciarone C.M., Franzo G., Berto G., Drigo M., Ramon G., Koutoulis K.C., Catelli E., Cecchinato M. (2018). Evaluation of 793/B-like and Mass-like vaccine strain kinetics in experimental and field conditions by real-time RT-PCR quantification. Poultry Science. 97(1):303-312.

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